RNA interferentie: Diepvriesbibliotheek

Een gen uitschakelen is de beste manier om te weten te komen wat de functie ervan is. Onderzoekers doen dat door virusmateriaal met kleine stukjes RNA in de cel te brengen. Tot nu toe moesten ze die stukjes zelf maken. Maar met een bibliotheek vol stukjes RNA kunnen genetici een poosje vooruit.

Knock down
Twee maanden werktijd
Bestellen via Albinusnet
Wederzijds leren
Trots op lab

Prof. Rob Hoeben (Moleculaire Celbiologie) schafte samen met collega’s in AMC en Erasmus MC zo’n bibliotheek aan. De groep van Hoeben gebruikt het materiaal onder meer voor onderzoek naar stamceltherapie en naar de aangeboren afweer. Maar de bibliotheek staat natuurlijk ook ter beschikking van anderen.

Wie verwacht er in een knusse omgeving een boek te kunnen lezen, komt bedrogen uit. De bibliotheek die sinds kort aanwezig is op de tweede verdieping van het Onderzoeksgebouw, vormt met 80 graden onder nul beslist geen aangename verblijfplaats.

En de twee vriezers zijn niet gevuld met boeken, maar met 1800 doorzichtige kunststofplaten die elk een rooster van 96 buisjes bevatten. In ieder buisje bevinden zich synthetische dna-moleculen, gekweekt in bacteriën. Elk van die moleculen is geschikt om een bepaald gen uit te schakelen in levende cellen.

terug naar boven

Knock down
‘We zijn al heel lang bezig om dna-materiaal via virussen in cellen te brengen, zodat we een gen naar keuze kunnen uitschakelen’, vertelt prof. dr. Rob Hoeben (Moleculaire Celbiologie). Zijn onderzoeksgroep, het Laboratorium voor Virus- en Stamcelbiologie, is daarin inmiddels ‘redelijk succesvol’ geworden.

‘Dat is voor een groot deel te danken aan analist Martijn Rabelink, de stille kracht. Veel andere afdelingen maken tegenwoordig gebruik van onze Virale Vector Faciliteit.

Het uitschakelen van een gen is namelijk heel handig voor functioneel onderzoek. Je neemt bijvoorbeeld gekweekte cellen van een mens, schakelt een bepaald gen uit – in vaktermen: knock-down – en kijkt wat er gebeurt.’ Door de knock-down kunnen onderzoekers meer inzicht krijgen in de functie van een gen en de rol die het speelt binnen een biologische pathway, een ingewikkeld circuit van biochemische reacties binnen de cel.

De knock-down van een gen bewerkstelligen is een stuk lastiger dan de naam doet vermoeden. Kernbegrip is rna-interferentie (rnai), een techniek waarvoor in 2006 de Nobelprijs werd uitgereikt. Een onschadelijk gemaakt virus fungeert als ‘vector’ en brengt kleine stukjes rna in de cel.

Dat zogenoemde short-hairpin rna is maar ongeveer 45 basen lang en in een haarspeldbocht (hairpin turn) gevouwen. Eenmaal in de cel splitst de cellulaire machinerie het short-hairpin rna in één streng, die vervolgens via een complex van reacties heel specifiek het beoogde gen het zwijgen oplegt.

terug naar boven

Twee maanden werktijd
Hoeben: ‘Voor elk gen dat je stil zou willen leggen, kunnen we hier zelf het benodigde stukje molecuul produceren en in een virusvector plaatsen. Maar dat kost een promovendus wél twee maanden werktijd.’ Toen er dus twee bedrijven op de markt kwamen die het rna-materiaal kant-en-klaar aanboden, was Hoeben geïnteresseerd.

‘En ik niet alleen: bij een promotie in Amsterdam kwam ik Rogier Versteeg uit het amc tegen die er al mee bezig was. Snel daarna voegde Sjaak Philipsen van het Erasmus mc zich bij ons. Ons doel was in één keer de hele bibliotheek aan te schaffen, in plaats van telkens losse componenten. We hebben eerst getest welk bibliotheek het beste was. Die van The rnai Consortium (trc), aangeboden door Sigma-Aldrich, stak met kop en schouders uit boven de concurrent.

Als consortium van drie umc’s zijn we toen gaan onderhandelen met Sigma-Aldrich. Uiteindelijk kwamen we een niet nader te noemen bedrag overeen - de deal was rond! We blijken nu – naast verschillende farmaceutische bedrijven - het eerste academische consortium te zijn dat de volledige collectie bezit.’

De mens heeft 20.000 genen, waarvan er zo’n 15.000 interessant kunnen zijn voor onderzoek. In de bibliotheek zitten dus 15.000 verschillende stukjes rna? ‘Ja, of eigenlijk nog meer, want voor elk gen levert Sigma-Aldrich vijf verschillende short-hairpins.

Niet elke short-hairpin zal werkzaam zijn, het bedrijf had niet de mogelijkheid dat zelf te testen. Bovendien kan de werkzaamheid afhangen van het type cellen waarin je de genexpressie wilt beïnvloeden. Dat zijn dus 75.000 stukjes rna – en dan nog maal twee, want we hebben zowel de menselijke collectie als die voor muizen gekocht.’

terug naar boven

Bestellen via Albinusnet
Al deze luxe is uiteraard niet alleen beschikbaar voor de groep van Hoeben, maar voor het gehele lumc. ‘Er komt een digitaal aanvraagformulier, hopelijk op het Albinusnet (het intranet van het LUMC, red), zodat afdelingen bij ons kunnen bestellen.

Wij pikken dan de bacterie met het gewenste short-hairpin dna uit een van de platen en brengen dat over op een voedingsbodem. In die bacteriën wordt het short-hairpin dna vermenigvuldigd. De afdeling moet zelf de ontstane genconstructen oogsten. Wij kunnen hen dan vervolgens weer assisteren met het vormen van een virus van dit dna-construct.’

Dat laatste vereist een biologisch veiligheidslab (niveau mlii), en daarvan zijn er circa vijftien binnen het lumc aanwezig. ‘We vragen de afdeling daarom om zelf zo’n veiligheidslab te regelen. Als ze er zelf geen bezitten, kunnen ze proberen op een andere afdeling ruimte te regelen. We raden belangstellenden altijd aan om contact op te nemen met Gijsbert van Willigen, de biologisch veiligheidsfunctionaris. Die weet wat waar beschikbaar is.’

Toch voorziet Hoeben wel dat er labs bij moeten komen. ‘Ik krijg nu al elke week een aanvraag binnen, terwijl we nog niet eens begonnen zijn. Eerst moeten we namelijk nog op orde komen; begin november kunnen we de eerste vectoren uitleveren.’ Overigens zal de drukte in het lab binnenkort misschien afnemen.

‘De overheid gaat de verschillende handelingen die bij deze techniek moeten worden uitgevoerd wellicht splitsen over risiconiveaus, zodat een deel van het werk ook in een minder strikt beveiligd lab kan worden uitgevoerd. Dat is waarschijnlijk zelfs veiliger, want nu voeren mensen handelingen met een laag risico uit in de nabijheid van handelingen met meer risico.’

terug naar boven

Wederzijds leren
Hoeben is erg enthousiast over de samenwerking met amc en Erasmus mc, en ook over die met Sigma-Aldrich. ‘We vormen een strategische alliantie met het bedrijf, waarbij er van beide kanten terugkoppeling is. Wij leren veel van hun ervaringen, zij leren van ons waar de markt behoefte aan heeft. En als we bepaalde dingen wensen, dan gaan ze voor ons aan de slag.’

De groep van Hoeben gaat de bibliotheek uiteraard ook gebruiken voor eigen onderzoek. ‘In eerste instantie binnen drie projecten. In het eerste willen we virussen zó modifi ceren dat ze zich alleen in tumoren kunnen vermenigvuldigen. Zo kun je het virus inschakelen als medicijn tegen kanker.

Verder willen de bibliotheek gebruiken voor ons onderzoek om vanuit stamcellen spiercellen en insulineproducerende cellen te maken. Ten slotte willen we de productie van virussen voor gentherapie verhogen door het verdedigingssysteem van de cellen waarin we het virus kweken, plat te leggen – met behulp van de hairpins.

Ook hopen we met het platleggen van het immuunsysteem meer inzicht te krijgen in de aangeboren afweer.’

terug naar boven

Trots op lab
Tot slot neemt Hoeben me mee het lab in, naar de vriezers waarin de kunststof platen staan en de labs waarin ermee gewerkt wordt. De ruimten zien er allemaal indrukwekkend verzorgd en high-tech uit.

‘We zijn er ook erg trots op’, vertelt Hoeben. ‘Onlangs leidden we een club Europese onderzoekers hier rond en die begonnen haast te kwijlen. Het is vooral zo bijzonder dat we voor elke soort virus waarmee we werken, een apart lab hebben.’ Voor het inbrengen van de short-hairpins speelt hiv, een zogenoemd lenti-virus, de rol van vector.

Is dat niet gevaarlijk? ‘Dat valt wel mee – ten eerste is meer dan 70 procent van het genoom verwijderd en kunnen er geen viruseiwitten meer worden gevormd. En omdat hiv zijn gastheer doodt, kunnen er geen sluimerende infecties ontstaan.’ Maar toch. Is Hoeben niet bang dat er potentiële bioterroristen bij hem komen werken?

‘Als je een gevaarlijk virus wilt vinden, moet je niet bij ons zijn. Nee, een slimme bioterrorist zal geen gebruik maken van de kreupele kasplantjes die wij hier gebruiken.’

Het originele artikel verscheen eerder in Cicero, het magazine van het LUMC te Leiden.

Laatst bijgewerkt op 30 november 2007

	0900-6655566 25 cent per minuut ma. en do. 10:00 tot 15:00 uur
	erfolijn@erfocentrum.nl